基因敲除、基因过表达是生物学领域研究基因功能必不可少的两种方法，结核分枝杆菌基因功能研究也需要用到基因敲除、基因过表达等。下面我们将就结核领域相关分子遗传工具进行简要介绍。
结核分枝杆菌基因过表达
基因过表达离不开合适的过表达质粒，结核分枝杆菌基因过表达质粒具有如下特点：
1、 穿梭质粒：能够在大肠杆菌及/或结核分枝杆菌中复制；
2、 多克隆酶切位点；
3、 合适的抗性基因。
• 游离型质粒
M. scrofulaceum（瘰疬分支杆菌）、M. fortuitum（偶发分支杆菌）等分枝杆菌本身具有质粒，而M. tuberculosis 等结核分枝杆菌没有质粒。最初用于结核分枝杆菌研究的质粒分为pMSC262（M. scrofulaceum）、pAL500（M. fortuitum）两大类，随后经过改造的pYUB12、pMV261质粒开始广泛使用，目前有报道并使用较多的游离型质粒还有pLO87、pLO86等。
• 整合型质粒
整合型质粒也是结核分枝杆菌基础研究常用的质粒，含有整合酶（Int）、结核分枝杆菌噬菌体附着位点（attp），能够整合到结核基因组上，具有高效整合、拷贝数单一、不容易丢失等特点，应用于结核蛋白-蛋白研究、基因功能研究、回补菌株制备等。pMV361、pKM461、pST-KiT、pST-KT、pRibo-APEX2等质粒都是常见的整合型质粒。pMV361质粒含有结核 hsp60 基因启动子，整合到结核基因组上后可持续表达；pKM461、pST-KiT、pST-KT、pRibo-APEX2等为诱导性质粒，需添加诱导剂才能表达，这些质粒在结核蛋白表达纯化中常用。
Table1. 结核分枝杆菌基因研究常用载体
结核分枝杆菌基因突变或敲除
结核分枝杆菌基因突变方法主要有转座子介导的随机基因敲除突变以及同源重组介导的靶向基因敲除突变。
• 转座子介导的结核分枝杆菌基因突变
转座因子或转座子是一类在很多后生动物中(包括线虫、昆虫和人)发现的可移动的遗传因子。 一段基因可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子，可分插入序列(IS因子)，转座(Tn)，转座phage。
第一个转座子介导的分枝杆菌突变体文库由Guilhot C等于1994年构建，Guilhot C等在含有pAL5000、pUC18复制子的pCG63质粒中整合了Tn611转座子序列并将构建好的质粒命名为pCG79（pCG79质粒为温度敏感型质粒，30℃时在结核分枝杆菌中稳定存在，37℃时迅速丢失迅速），随后将pCG79质粒电转到耻垢分枝杆菌M. smegmatis mc² 155中，经验证Tn611能随机地插入到耻垢分枝杆菌基因组不同的位点，成功获得了耻垢分枝杆菌突变菌株文库，为BCG、H37Rv等菌株基因突变文库构建提供了新的研究工具。
然而，这种方法因其温度敏感性，使得Tn611从耻垢分枝杆菌基因组上脱离，这是该方法的显著缺点，后来的噬菌体介导Tn611转座子进入耻垢分枝杆菌成功解决了该缺点。
Fig1. Tn611转座子介导的耻垢分枝杆菌基因突变模式图
Tn611转座子用于诱发耻垢分枝杆菌基因突变后，IS1096、Tn5370、Tn552、MycoMarT7及Himar1等不同类型的转座子系统开始用于结核分枝杆菌不同菌株来构建突变体文库。
Ruth A. McAdam等用温度敏感型phAE87噬菌体载体介导Tn5370转座子，感染结核分枝杆菌后收集单菌落培养，后提取基因组进行测序，发现转座现象不是完全随机的并且转座位点一般在GC含量54%-62%处；用突变菌株感染免疫缺陷小鼠验证突变对结核分枝杆菌菌株毒力影响，发现Rv1290c基因敲除后，结核分枝杆菌H37Rv菌株毒力显著减弱。但是该方法明显的缺点在于其转座不随机。
Himar1转座子具有的转座随机性强的优点，Lamichhane等用Himar1转座子诱导结核分枝杆菌基因突变，来研究结核分枝杆菌必需基因及非必需基因。目前，通过Himar1转座子构建的结核分枝杆菌H37Rv突变已有4300多株。TraSH (transposon site hybridization)策略用来分析对结核分枝杆菌生长、感染巨噬细胞及小鼠有重要影响的基因。Himar1、TraSH对区分结核分枝杆菌必需基因与非必需基因发挥了重要功能。
Mycbrowser网站统计了多种结核分枝杆菌基因组遗传信息，必需基因及非必需基因都有标注，网址：
https://mycobrowser.epfl.ch/
Fig2. 转座子构建结核分枝杆菌基因突变文库模式图
Signature-tagged mutagenesis (STM)是在传统的转座子系统基础上，将不同的用于基因测序的标签序列与转座子连接，便于测序并且使用的动物模型大大减少，但是无法区分结核必需、非必需基因，后续还需进行二次排除阴性突变体，花费时间久。
• 同源重组介导的结核分枝杆菌基因突变
同源重组(Homologous Recombination) 是指发生在非姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
20世纪80年代，同源重组技术开始用于构建基因敲除小鼠构建，其技术路线大致如下：
1、构建重组基因载体﹔
2、用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔
3、用选择培养基筛选已击中的细胞﹔
4、将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
Fig3. 同源重组进行基因敲除模式图
1996年Balasubramanian等利用同源重组原理构建结核分枝杆菌基因突变菌株，他们首先将抗性基因整合到待敲除目的基因片段内部，构建了含有抗性基因的质粒，后将质粒线性化，通过电转的方法将线性化质粒转入结核分枝杆菌，通过抗性筛选获得阳性突变菌株。该方法的缺点是诱导突变效率非常低。
为了提高结核分枝杆菌同源重组效率，Hinds等在Balasubramanian的研究基础上，用紫外线预先照射或碱性处理含有抗性基因的单链噬菌体DNA载体或质粒，然后再将处理后的单链噬菌体DNA载体或质粒电转到结核分枝杆菌中，这种方法的确可以提高重组效率，但是由于紫外线导致的载体DNA损伤，可能会诱发二次突变，使已经重组的突变体再次发生修复而导致重组失败。
• 噬菌体重组蛋白介导的同源重组
该方法也利用噬菌体同源重组蛋白系统如GP60、GP61，待敲除基因的双链或单链DNA序列在GP60、GP61存在时可与目的基因发生同源重组，操作简单，用于耻垢分枝杆菌阳性率高，但是在结核分枝杆菌中阳性率很低。
• 噬菌体介导的同源重组
噬菌体能够通过attP、attB 特异性序列位点，使含有抗性基因的重组质粒与待敲除目的基因重组，将敲除基因从结核基因组上替换下来，该方法最大优点就是重组效率非常高，可达到95%左右。随着该方法的改进，现在的phAE159已经具备高容量，可容纳大片段DNA，是比较常用的质粒载体。但是该方法需要经过构建同源臂、包装噬菌体、噬菌体感染菌株等多个步骤，操作复杂，周期长。
Fig4. 噬菌体介导的同源重组基因敲除模式图
结核分枝杆菌基因沉默
研究基因的功能，可以从DNA、RNA、蛋白水平进行研究，DNA水平可以进行基因突变、基因敲除，RNA水平可以通过调控基因转录或RNA干扰使mRNA降解，蛋白水平可以通过调控蛋白过表达或水解。结核分枝杆菌必需基因是药物开发的靶点，但是对其基因敲除后结核分枝杆菌不能正常生长，因此对其研究只能从DNA转录、RNA及蛋白水平研究。RNA干扰、调控结核分枝杆菌蛋白水解、CRISPRi技术是研究结核分枝杆菌基因沉默的常用技术。
RNA干扰是生物学研究常用的工具之一，目的基因小片段反义RNA（siRNA）能与核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶等酶形成沉默复合体(RISC，RNA-induced silencing complex)，siRNA能与mRNA结合并引导沉默复合体在结合处定位发挥mRNA降解功能。
Parish等在结核领域首次使用了反义DNA技术，乙酰胺能诱导耻垢分枝杆菌乙酰胺酶的表达，Parish选取了乙酰胺酶上游转录调控区与耻垢分枝杆菌hisD基因反义DNA序列重组连接，构建了含有二者重组序列的重组质粒pAHA5，后将质粒电转到耻垢分枝杆菌并获取阳性菌株；当用乙酰胺诱导时，含有hisD 基因反义DNA序列的菌株表现出营养缺陷状况，依赖组氨酸生长。后来反义RNA逐渐开始广泛应用与结核分枝杆菌基因沉默研究。
与反义DNA类似的是反义肽核酸技术（antisense peptide nucleic acids），该技术依据的原理是肽核酸能与DNA或RNA结合，抑制DNA转录或RNA翻译，具有不易被核酸酶、蛋白酶降解，稳定性高的特点。
• 调控结核分枝杆菌蛋白降解技术
由Kim等人开发，该技术原理是SspB适配子蛋白能识别带有DAS+4多肽标签的目的蛋白并使目的蛋白被结核分枝杆菌ClpXP蛋白酶降解。调控蛋白降解的技术只需构建一种调控SspB适配体蛋白表达的诱导型蛋白表达载体及一种目的基因-DAS+4标签重组质粒即可，技术稳定性高，已成功研究了RpoB、ClpP1/P2、Mmpl3等基因。
• CRISPR 介导的结核分枝杆菌基因沉默
CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。
CRISPR-Cas9核酸酶是由细菌DNA切割酶Cas9与一条可以结合靶DNA序列的短链导向RNA序列（sgRNA）所组成，当前人们主要利用它来生成靶向性DNA断裂，由此导入一些遗传性改变；sgRNA还能将Cas9蛋白定位到目的基因的上游启动子区或者目的基因内部，阻止RNA聚合酶启动转录或延伸，使基因转录沉默。目前CRISPR-Cas9系统广泛应用于植物、动物、细菌、病毒、细胞等各种生物模型，可发挥基因敲除、基因突变、基因插入、基因沉默等多种功能。
Choudhary、Singh最早将CRISPR-Cas9系统用于结核分枝杆菌基因沉默研究，他们利用四环素诱导型载体构建了含有Cas9、sgRNA序列的重组质粒，Cas9基因能整合到结核基因组上，在四环素存在时sgRNA会转录、Cas9会表达，Cas9在不同sgRNA引导下定位于结核分枝杆菌基因组不同位置，可同时导致多个基因沉默。但是CRISPR-Cas9系统存在脱靶效应，应用在结核分枝杆菌基因沉默时还需要考虑基因之间的极性问题（不同基因可能共用相同的启动子，或者某个基因启动子在另一个基因内部等等）。
Fig5. CRISPR-Cas9介导的结核分枝杆菌基因沉默模式图
目前CRISPR-Cas9还没有成功敲除结核分枝杆菌基因，仍需深入研究其在结核分枝杆菌中发挥功能的机制。
参考文献
Chiranjibi Chhotaray, Yaoju Tan, Julius Mugweru, Md Mahmudul Islam, H.M. Adnan Hameed, Shuai Wang, Zhili Lu, Changwei Wang, Xinjie Li, Shouyong Tan, Jianxiong Liu, Tianyu Zhang. Advances in the development of molecular genetic tools for Mycobacterium tuberculosis. J Genet Genomics. 2018 Jun 18. pii: S1673-8527(18)30114-0.
2138am太阳集团生物采用噬菌体介导的同源重组进行基因敲除，已成功构建500多株结核分枝杆菌基因敲除菌株，并可定制质粒构建、基因定点突变、蛋白表达纯化等结核分枝杆菌相关技术服务。
- 技术优势：噬菌体介导的同源重组基因敲除技术，阳性率95%以上；
- 资源优势：已成功构建结核分枝杆菌4000余个基因的噬菌体文库和基因过表达质粒；
- 平台优势：华北、华东、华中、华南4处实验基地；
- 宿主兼容性：广泛适用于结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和牛结核分枝杆菌等；
- 专业技术团队：以结核领域专家和博士为核心的专业技术团队，可提供后续技术支持和实验服务。
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