Mycobacterium tuberculosis H37Rv ∆ppe2敲除菌株在PPE2功能研究中的应用
一、研究背景
结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，能通过自身的多种武器成功打败巨噬细胞并在巨噬细胞细胞质内完成复制，最终逃脱人体免疫系统监视[1]，结核分枝杆菌PE、PPE蛋白家族就是这些武器中的典型。结核分枝杆菌PE、PPE蛋白家族成员多达180个左右，该蛋白家族成员在其蛋白N端富含脯氨酸、谷氨酸，根据蛋白C端氨基酸序列不同又可细分为PE、PE_PGRS、PPE、PPE-SVP等[2]。
Figure1. PE、PPE蛋白家族结构特点及分类
ESX分泌系统可分为ESX1、ESX2、ESX3、ESX4、ESX5五类，对结核分枝杆菌逃脱免疫系统至关重要。许多PE、PPE蛋白家族成员如PPE36、PPE68、PE_PGRS33、PE_PGRS63、PPE_MPTR34等定位在结核分枝杆菌细胞壁上，这些蛋白的分泌离不开结核分枝杆菌的ESX分泌系统[2]。
Figure2. ESX分泌系统参与PE、PPE蛋白家族成员转运
目前报道PE、PPE蛋白家族在免疫调控中发挥多种功能。
PE25 / PPE41是第一个被解析出晶体结构的PE、PPE蛋白家族成员，PE25、PPE41能形成二聚体并可能参与巨噬细胞信号转导过程[3]；PE_PGRS33、PE_PGRS11、PE_PGRS17、PPE_MPTR34能通过结合或调控巨噬细胞TLR-2进而控制细胞凋亡及细胞因子的释放[3]；PPE54能影响巨噬细胞吞噬泡的成熟及转运等等[3]。
PE、PPE蛋白如何定位到结核分枝杆菌细胞壁、结合巨噬细胞哪些蛋白并调控细胞因子释放、调控细胞凋亡等相关机理仍需深入研究。
二、研究项目
PPE蛋白N端富含脯氨酸、谷氨酸，临床结核病人体内能检测到PPE2等蛋白抗体，表明PPE蛋白能引起宿主细胞免疫反应。病原菌感染细胞后能被巨噬细胞产生的活性氧、活性氮等杀死，然而结核分枝杆菌能通过调控巨噬细胞活性氮的生成而逃脱被巨噬细胞杀死的命运[4-6]。结核分枝杆菌PPE2蛋白在NO胁迫或感染巨噬细胞后表达量升高，表明PPE2可能参与调控巨噬细胞NO生成过程，但是具体机制尚不清楚[4-6]。NCBI蛋白结构保守域数据库显示PPE2可能是COG5651类蛋白，参与细胞运动和分泌[7]。Khalid Hussain Bhat等人通过比对PPE家族蛋白序列，发现PPE2蛋白C端473-481位置有核定位信号序列，同时在319-340位置处有亮氨酸拉链结构，这与真核细胞转录因子结构类似，表明PPE2蛋白可能定位到巨噬细胞细胞核并调控inos转录[7]。在此理论假设前提下，Khalid Hussain Bhat等以M. smegmatis为研究对象，构建了M. smegmatis pEGFP-PPE2、pEGFP-∆NLS-PPE2等过表达菌株并感染巨噬细胞，发现PPE2蛋白定位于细胞核并能下调巨噬细胞NO的生成，证明了假设的准确性[7]。PPE2蛋白分泌需要ESX分泌系统，但是其分泌机制还有待深入研究[5]。
目前还没有PPE2在 Mycobacterium tuberculosis H37Rv中的研究报道。
Figure3. PPE2蛋白定位于巨噬细胞细胞核
Figure4. PPE2蛋白能下调iNOS的转录及表达
三、研究思路
思路1：NF-KB、IRF-1等蛋白结合结核分枝杆菌蛋白的研究
NF-kB及IRF-1是激活inos转录的经典蛋白，受病毒感染等会被激活，并调控细胞产生炎症因子。结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，PPE2发挥类似NF-kB竞争性抑制剂的功能，巨噬细胞NF-kB信号通路是否受到抑制不得而知。
思路2：PPE2蛋白转运机制研究
思路3：Mycobacterium tuberculosis H37Rv ∆ppe2敲除菌株感染巨噬细胞研究
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参考文献
1. S. Upadhyay, E. Mittal and J. A. Philips. Tuberculosis and the art of macrophage manipulation. Pathogens and Disease, 2018, Vol. 76, No. 4.
2. Matthias I. Grchel, Fadel Sayes, Roxane Simeone, Laleh Majlessi and Roland Brosch. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. NATURE REVIEWS | MICROBIOLOGY, VOLUME 14 | NOVEMBER 2016 | 691.
3. S. Fishbein, N. van Wyk, R. M. Warren and S. L. Sampson. Phylogeny to function: PE/PPE protein evolution and impact on Mycobacterium tuberculosis pathogenicity. Molecular Microbiology (2015) 96(5), 901–916.
4. Bhat KH, Das A, Srikantam A, Mukhopadhyay S. PPE2 protein of Mycobacterium tuberculosis may inhibit nitric oxide in activated macrophages. Ann N Y Acad Sci. 2013 Apr;1283:97-101.
5. Sangita Mukhopadhyay and Sudip Ghosh. Mycobacterium tuberculosis: what is the role of PPE2 during infection? FUTURE MICROBIOLOGYVOL. 12, NO. 6.
6. Abraham PR, Latha GS, Valluri VL, Mukhopadhyay S. Mycobacterium tuberculosis PPE protein Rv0256c induces strong B cell response in tuberculosis patients. Infect Genet Evol. 2014 Mar;22:244-9.
7. Bhat KH, Srivastava S, Kotturu SK, Ghosh S, Mukhopadhyay S. The PPE2 protein of Mycobacterium tuberculosis translocates to host nucleus and inhibits nitric oxide production. Sci Rep. 2017 Jan 10;7:39706.
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